Nat Neurosci︱曹鹏实验室发现痛觉在物种间生存斗争中的重要功能

撰文︱曹   鹏

责编︱王思珍

物竞天择，适者生存。生存斗争（struggle for existence）作为物种适应环境的主要行为方式，在漫长的生物进化过程中扮演了重要的角色[1]。面对自然界中的天敌威胁，人类和动物进化出一系列相对保守的物种间生存斗争行为。该研究领域的先驱Fanselow 等人提出了经典的理论模型“Predatory Imminence Continuum”[2]，用于描述物种间生存斗争行为与“猎物-天敌”距离之间的对应关系。该模型指出，当猎物与天敌相距较远时，猎物优先采取静止不动和逃跑等防御策略；一旦与天敌正面交锋无处遁逃时，猎物则不得不采取积极的正面应对措施，开启防御攻击模式。防御攻击行为（defensive attack）是猎物对付天敌的最后一道防线，而这一重要的生存斗争行为的神经机制是一个长期悬而未决的科学问题。

2022年1月3日，北京生命科学研究所的曹鹏课题组在神经科学著名期刊Nature Neuroscience上在线发表了题为“Mechanically evoked defensive attack is controlled by GABAergic neurons in the anterior hypothalamic nucleus”的研究论文。该研究发现，在陷入无法逃跑的绝境时，伤害性机械刺激是触发本能防御攻击行为的关键刺激（key stimulus），而下丘脑前核（anterior hypothalamic nucleus, AHN）中的γ-氨基丁酸能神经元（GABAergic neurons）则是编码伤害性机械刺激的关键神经群。这一研究不仅阐明了本能防御攻击行为的神经机制，还揭示出伤害性机械刺激引发的痛觉在物种间的生存斗争中的重要功能。（拓展阅读：曹鹏课题组最新研究进展，详见“逻辑神经科学”报道：Neuron︱曹鹏实验室发现重复刻板行为的闭环神经机制；eLife︱单细胞测序和神经环路分析联合揭示大脑启动攻击/防御本能行为的分子遗传编码机制）。

伤害性机械刺激是触发小鼠防御攻击行为的关键刺激

首先，作者使用C57BL/6小鼠进行了一系列行为学实验，探寻触发防御性攻击行为的关键刺激（key stimulus）。第一，作者在仿真蛇上涂抹蛇的气味以提供天敌的嗅觉信息，或者连接鳄鱼夹以施加伤害性机械刺激。含有天敌嗅觉信息的仿真蛇并没有触发小鼠的防御攻击行为，而当鳄鱼夹对小鼠尾部施加持续的伤害性机械刺激时，小鼠对仿真蛇发动撕咬的攻击行为。这一行为在黑暗中依然存在，暗示视觉可能并不参与在这一行为的触发。第二，作者把鳄鱼夹和无威胁的物体（如塑料瓶盖，木块等）连接，发现当鳄鱼夹“咬住”小鼠尾部时同样能触发防御攻击行为。这些结果说明，鳄鱼夹连接的物体并不重要，重要的是鳄鱼夹提供的伤害性机械刺激。第三，作者使用了Cre 酶依赖的白喉毒素 iDTR-DT系统，通过腹腔注射白喉毒素DTX杀死背根神经节中的Mrgprd⁺神经元，同样可以显著减弱防御攻击行为。因为背根神经节中的Mrgprd⁺神经元是一类对伤害性机械刺激敏感的感觉神经元，所以这个实验结果再次证明伤害性机械刺激可以通过Mrgprd⁺神经元引发防御攻击行为。第四，作者证明，这种机械刺激触发的防御攻击行为无性别差异。第五，作者通过改变仿真蛇的重量和实验环境的面积来调节防御情景中的“可逃脱性”，发现“可逃脱性”的高低也可能是机械刺激触发防御攻击行为的一个决定因素。总之，以上一系列实验结果表明：在无法逃脱的情况下，伤害性机械刺激可能是触发防御攻击行为的关键刺激（key stimulus）（图1）。

图1 伤害性机械刺激触发小鼠防御攻击行为

（图源：Xie et al., Nat Neurosci, 2022）

vGAT+ AHN神经元是触发小鼠防御攻击行为的必要条件

接着，作者探索了防御攻击行为的中枢机制。他们运用荧光原位杂交技术（FISH），发现AHN脑区中的神经元类型主要为vGAT阳性（vGAT⁺）神经元。为了实现对vGAT⁺ AHN神经元进行失活，作者联合使用了Cre-LoxP系统和抑制性光遗传工具GtACR1。在vGAT-IRES-Cre小鼠的AHN脑区注射了AAV-DIO-GtACR1-2A-EGFP并包埋了光纤，诱导 GtACR1 蛋白特异性表达在AHN脑区vGAT⁺神经元中。作者使用连接鳄鱼夹的仿真蛇“咬”住小鼠尾巴，诱导小鼠攻击仿真蛇，然后给予持续蓝光抑制vGAT⁺ AHN神经元。结果显示，与对照组小鼠相比，实验组小鼠的攻击频率和攻击时长显著地降低了，暗示vGAT⁺ AHN神经元是伤害性机械刺激引发的防御攻击行为的必要条件（图2）。

图2 vGAT+ AHN神经元是触发小鼠防御攻击行为的必要条件

（图源：Xie et al., Nat Neurosci, 2022）

vGAT⁺ AHN神经元对机械刺激的强度和位置进行编码

为了揭示vGAT⁺ AHN神经元与伤害性机械刺激之间的联系，作者使用了钙成像光纤记录系统，在vGAT-IRES-Cre小鼠AHN脑区注射AAV-DIO-GCaMP7，观测了vGAT⁺ AHN神经元在不同场景下接受不同刺激时的钙信号。自由活动的小鼠在尾部被鳄鱼夹“咬”住后，钙信号出现大幅升高，在其他场景中（如自由活动或探索），vGAT+ AHN神经元的钙信号有轻微的幅值升高。作者还发现，在社交场景下当实验小鼠被CD1小鼠攻击时，vGAT+ AHN神经元的钙信号也显著上升。这些数据表明vGAT+ AHN神经元优先响应伤害性机械刺激。

接着，作者应用在体单细胞记录技术深入解析单个vGAT⁺ AHN神经元对机械刺激的编码机制。在vGAT-IRES-Cre小鼠AHN 脑区中注射 AAV-DIO-ChR2-mCherry，待病毒充分表达后，固定小鼠头部，垂直插入同时包裹光纤的多通道电极。应用这一“光电极”技术，可实现对单个vGAT⁺ AHN神经元的胞外记录。作者对15个vGAT⁺ AHN细胞进行了系统研究，发现它们都偏好于鳄鱼夹施加的机械刺激，而对蛇的气味刺激反应较弱。作者还使用了Von Frey纤维丝进行测试实验，发现vGAT⁺ AHN神经元偏好对侧躯体的伤害性机械刺激，并可以编码不同的机械刺激强度（图3）。

图3 vGAT+ AHN神经元对机械刺激的强度和位置进行编码

（图源：Xie et al., Nat Neurosci, 2022）

vGAT⁺ AHN神经元上游的单突触神经传入

为了理解vGAT⁺ AHN神经元对伤害性机械刺激编码的信息来源，作者使用了Rabies Virus跨突触逆向示踪法，对vGAT⁺ AHN神经元的上游投射网络进行了重建。他们发现，vGAT⁺ AHN神经元与处理痛觉相关信息的脑区（如LPB和PVT）形成单突触连接。作者采用化学遗传学的方法同时失活LPB和PVT两群神经元，发现伤害性机械刺激触发的防御攻击行为显著地降低了。除此而外，vGAT⁺ AHN神经元还会接受与攻击行为有关的下丘脑腹内侧核和外侧膈核，与捕食者气味信息相关的内侧杏仁核，以及下丘脑后核, 乳头前核背侧区，腹侧前运动核和 海马下托等等。以上逆行示踪结果为我们重构了以vGAT⁺ AHN为核心的防御攻击相关的神经网络（图4）。

图4 vGAT+ AHN神经元上游的单突触神经传入

（图源：Xie et al., Nat Neurosci, 2022）

vGAT⁺ AHN神经元光激活可以触发小鼠的防御攻击行为

接下来，作者使用光遗传学手段进一步检验vGAT⁺ AHN神经元是否是防御攻击行为的充分条件。在vGAT-IRES-Cre小鼠AHN脑区中注射AAV-DIO-ChR2-mCherry并包埋光纤，然后进行了一系列行为学研究。作者发现，光激活vGAT⁺ AHN神经元可有效触发小鼠对仿真蛇以及真实蛇的防御攻击，但对社交同伴并不发动攻击。不仅如此，光激活AHN vGAT+神经元还可以抑制社交攻击行为。因此，vGAT⁺ AHN神经元是触发小鼠防御性攻击行为的充分必要条件（图5）。

图5 vGAT+ AHN神经元光激活可以触发小鼠的防御攻击行为

（图源：Xie et al., Nat Neurosci, 2022）

vGAT⁺ AHN-vlPAG 通路是触发小鼠防御攻击行为的充分必要条件

为研究vGAT⁺ AHN神经元调控防御攻击行为的环路机制，作者首先使用了SynaptoTag 顺行示踪法，在vGAT-IRES-Cre小鼠的AHN中注射了AAV-DIO-SynaptoTag，发现vGAT⁺ AHN神经元的下游投射，包括视前内侧区MPA、外侧膈核LS、内侧下丘脑腹侧区VMH、乳头前核背侧区PMD、中央导水管周围灰质腹外侧区vlPAG等。已知vlPAG和LS均参与攻击相关的行为，因此作者对vGAT⁺ AHN-vlPAG和vGAT⁺ AHN-LS通路进行了对比研究。通过激活投射到vlPAG和LS处的vGAT⁺ AHN神经元纤维末梢，发现vGAT⁺ AHN-vlPAG通路的激活可以有效触发小鼠的防御攻击行为，而vGAT⁺ AHN-LS通路则不行。以上实验结果证明小鼠的防御攻击行为依赖于AHN与vlPAG的抑制性突触连接。最后，作者使用了光遗传学抑制和化学遗传学抑制的双重手段对vGAT⁺ AHN-vlPAG通路进行了验证。作者发现，通过上述方法抑制投射到vlPAG的vGAT⁺ AHN神经元轴突末梢，能够显著地阻断防御攻击行为的产生。这些结果表明，vGAT⁺ AHN-vlPAG通路的激活是触发小鼠防御攻击行为的充分必要条件（图6）。

图6 vGAT+ AHN-vlPAG 通路是触发小鼠防御攻击行为的充分必要条件

（图源：Xie et al., Nat Neurosci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本文揭示了vGAT+ AHN神经元是响应伤害性机械刺激并触发哺乳动物防御攻击行为的关键神经元。本文不仅揭示了防御攻击行为的神经环路机制，也可能为焦虑、创伤后应激障碍等精神疾病的发病机理和治疗策略提供新的启发。基于目前的研究，对AHN进行单细胞测序等方面的分析将有助于进一步揭示调控哺乳动物防御攻击行为的神经环路和遗传编码机制。此外，曹鹏老师实验将继续在本能行为的神经环路机制以及神经系统疾病的发病机理和治疗方面进行深入研究。同时也欢迎有志于从事这方面科学研究的同仁加入曹鹏老师研究团队。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41593-021-00985-4 

谢志勇（后排右一），谷华婷（前排左五），黄美珠（前排左二），曹鹏研究员（前排右五）

（照片提供自：曹鹏实验室）

北京生命科学研究所曹鹏实验室的谢志勇、谷华婷、黄美珠为论文的共同第一作者，曹鹏研究员为论文的通讯作者。实验室其他成员（程欣宇、尚从平、陶婷、李大鹏）也对该研究做出了重要贡献。中科院动物所的张知斌实验室、河北医科大学的张凡实验室、南京中医药大学的唐宗湘实验室、北京生命科学研究所的占成实验室也参与了此项课题，做出了重要贡献。该研究论文得到了北京生命科学研究所和国家自然科学基金委员会的大力资助。

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参考文献（上下滑动查看）  

1. Darwin, C. On the Origin of Species, Chapter III: Struggle for existence. 71-90 (1859)

2. Fanselow, M. S. & Lester, L. S. A functional behavioristic approach to aversively motivated behavior: Predatory imminence as a determinant of the topography of defensive behavior. Evolution and Learning, 185-211 (1988).

制版︱王思珍

本文完